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WESTERN BLOT o WESTERN BLOTTING

Etimologia : da blotting = capillarità  / modalità con cui avviene il trasferimento /.
In biologia molecolare, tecnica immunochimica finalizzata all’individuazione di una specifica proteina in un dato campione. Il riconoscimento della determinata proteina avviene mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici.
Nella tecnica del ‘Western blotting’, le proteine vengono risolte per elettroforesi su gel di poliacrilammide e trasferite, per elettrocapillarità, (blotting) su di una membrana di nitrocellulosa o nylon.
Ai fini della rilevazione delle proteine si fa ricorso all’ibridazione del filtro (membrana) con anticorpi specifici. La tecnica si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo.
Innanzi tutto, quindi, le proteine del campione vengono separate su di un gel in base alle loro dimensioni (elettroforesi su gel). In questa fase si procede ad una centrifugazione e bollitura per la denaturazione delle proteine in sample buffer. Le proteine dal gel vengono poi trasferite su membrana (preferibilmente su nitrocellulosa) mediante un campo elettrico (trasferimento su membrana). In tal caso il gel viene interposto fra alcuni strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo. Si ha migrazione delle proteine verso l’elettrodo positivo ed il loro legarsi alla membrana a seguito dell’applicazione di un campo elettrico. Il tutto viene fatto alla temperatura di 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine stesse. In terza fase si fa ricorso a saturazione (o “blocking”) per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana (si ha blocco dei siti aspecifici della membrana, di solito con albumina bovina/BSA o latte); il riconoscimento della proteina specifica legata alla membrana avviene da parte dell’anticorpo primario (legame dell’anticorpo primario) che non va a legare le altre proteine immobilizzate sulla membrana stessa; la funzione dell’anticorpo secondario che subentra in questa fase (coniugato ad un enzima AO o HRP-perossidasi) consiste nel riconoscimento specifico dell’anticorpo primario, precedentemente legato alla proteina immobilizzata sulla membrana; infine si ha chemioluminescenza (rivelazione o “detection”) di un substrato scisso da parte dell’enzima coniugato all’anticorpo secondario: il substrato viene convertito dall’enzima in un precipitato colorato (i substrati che vengono metabolizzati dalla perossidasi/HRP emettono luce).
Se si procede per l’identificazione del DNA, la tecnica prende il nome di “Southern blot” (dal nome del suo ideatore, il biologo inglese Edwin Southern); laddove invece si proceda con l’identificazione di RNA e proteine, le tecniche prendono rispettivamente i nomi (per mera analogia) di “Northern blot” e “Western blot”. A dare il nome di Western blot alla tecnica fu W. Neal Burnette nel 1981 in analogia al nome della tecnica Southern blot.
Il metodo, detto anche immunoblot, fu messo a punto nel laboratorio di George Stark a Stanford.