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NORTHERN BLOT o NORTHERN BLOTTING

Etimologia : da blotting = capillarità  / modalità con cui avviene il trasferimento /.
In biologia molecolare, tecnica standard di laboratorio per l’identificazione della dimensione e della quantità di specifiche molecole di RNA da un campione. Generalmente viene utilizzata per lo studio dell’espressione genica.
L’RNAm (o “messaggero” in quanto – partendo dal DNA nucleare in cui si trova scolpita l’informazione genetica – la trasporta sino al luogo in cui sarà letta, vale a dire il sito citoplasmatico della sintesi proteica) viene prima isolato. Riscaldato ad una temperatura di 70 °C per 3-5 minuti, viene poi raffreddato in un bagno di ghiaccio fondente. Una piccola quantità di un agente denaturante viene aggiunta (formaldeide o formammide) per mantenere l'RNA privo di strutture secondarie. L'RNA deve essere infatti preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte temperature) in quanto – anche se detta tecnica risulta simile al Southern Blotting – l’RNA tende naturalmente a formare strutture secondarie stabili in soluzione.
Le molecole vengono poi separate con l’elettroforesi su gel di agarosio. Si procede quindi al trasferimento per capillarità (blotting) dell’RNA su membrana di nylon. Infine si passa all’ibridazione con una sonda marcata.
La sonda marcata viene aggiunta alla membrana con l’RNA da analizzare in tubi da ibridazione (circa 16 ore in stufe termostatate) in presenza di apposite soluzioni di ibridazione.
Dopo l’ibridazione, va rimossa la sonda non legata o legata in modo aspecifico alla membrana. Si procede quindi a lavaggi successivi ad una temperatura specifica con soluzioni a sale sempre più basso (SSPE o SSC).
I segnali vengono rivelati mediante autoradiografia con apposite lastre fotografiche.
Per la rimozione dell’ibridazione il filtro si fa bollire in H2O distillata e SDS (detergente). La stessa membrana può quindi essere ibridizzata più volte con sonde diverse.
Per quanto riguarda l’espressione del trascritto, il livello di espressione è alto in cuore, polmoni, cervello, placenta e testicolo; è basso in rene; è nullo in fegato, muscolo, pancreas.
Il tipo di mRNA prodotto : il cuore esprime un mRNA da 1,4 Kb, probabilmente dovuto a splicing alternativo, mentre negli altri tessuti si rileva un mRNA da 4,4 kb.
Se si procede per l’identificazione del DNA, la tecnica prende il nome di “Southern blot” (dal nome del suo ideatore, il biologo inglese Edwin Southern); laddove invece si proceda con l’identificazione di RNA e proteine, le tecniche prendono rispettivamente i nomi (per mera analogia) di “Northern blot” e “Western blot”.
La tecnica del Northern blot fu messa a punto nel 1977 da James Alwine e George Stark della Stanford University.